CLIA认证实验室中雄激素受体剪接变体7（AR-V7）的分析验证 | CTC专题

患有去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的患者通常会使用靶向雄激素受体(AR)配体结合区域的药物进行治疗。但是AR剪接变体7 (AR-V7)缺乏配体结合域，如果在循环肿瘤细胞中检测到AR-V7，可能与这些药物的耐药性有关。我们在CLIA认证实验室开发了一个AR-V7的检测试验。分离循环肿瘤细胞，将mRNA逆转录成cDNA。实时定量PCR检测内参转录本(ACTB beta-actin和GAPDH)、前列腺特异性转录本(前列腺特异性膜抗原PSA、前列腺特异性抗原PSMA和AR -全长AR-FL)和AR-V7。验证样本包括AR-V7表达的前列腺癌(LNCaP95)、38个外周血对照和21个来自CRPC患者的血液样本。该方法在外周血中可以检测到5个LNCaP95细胞，具有很高的分析灵敏度。相同批次以及不同批次实验LNCaP95细胞，相似的Ct值再现，显示出较高的分析精度(AR-V7 Ct ，CV为0.67%)。38例健康对照样本均为AR-V7阴性，诊断特异性高(100%)。在研究实验室和临床诊断实验室同时检测21份CRPC样本，证实了诊断准确性:AR-V7有4例阳性，17例阴性(准确率100%)。这是首次验证的临床检测AR-V7具有很高的分析灵敏度、精度、特异性和准确性的方法。

来自于詹姆斯•布坎南布雷迪泌尿研究所和泌尿系，约翰霍普金斯大学医学院的研究团队利用CTC富集，qPCR，sanger测序等技术验证了临床检测AR-V7分析的灵敏度、精度、特异性和准确性。

背景

雄激素途径的改变是前列腺癌进展的关键。抑制雄激素受体(AR)信号转导是许多前列腺癌药物的治疗目标。手术和放疗后残留或复发的患者采用化学去势(促性腺激素释放激素激活剂或抑制剂)治疗。在出现初步反应后，大多数患者会发展为进展性疾病，称为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。有趣的是，CRPC并不是雄激素独立的，一些旨在进一步抑制AR通路的药物显示出了提高生存率，包括阿比特龙和恩杂鲁胺。阿比特龙是一种CYP17A1抑制剂，可破坏肾上腺和前列腺内二氢睾酮(AR配体)前体的合成。而恩杂鲁胺通过拮抗结合到AR配体结合区域来抑制信号传导。然而，并非所有患者对这些新型AR靶向药物的反应都是一样的。大约20% - 40%的CRPC患者对这些药物的临床反应较差，几乎所有最初有反应的患者都获得了继发性耐药。人们提出了几种耐药机制。耐药的一种机制是对AR转录本的可变剪切，导致产生截短了的AR剪接变体7 (AR-V7)蛋白。
AR蛋白有四个结构域:N端结构域、DNA结合结构域、铰链区和雄激素结合的N端配体结合结构域。配体(双氢睾酮)与AR配体结合结构域的结合导致AR的核定位。在核中，AR的 N端结构域作为增殖信号和雄激素调控基因(如PSA)的转录激活因子。AR的剪接变体是在2008年发现的，它是通过将内含子的隐外显子剪接到编码dna结合结构域的上游外显子而产生。在22种已知的变体中，AR-V7是研究最广泛的变体，携带最多的预后信息。此外，AR-V7是唯一一种可以在临床样本中检测到的蛋白变体。AR-V7只包含完整长度(FL)中8个外显子中的前3个，然后是隐藏的外显子3，编码一个新的16个氨基酸的变异特异性肽。AR-V7缺乏蛋白的配体结合域，但保留转录活性。因此，AR-V7作为一种组成活性AR蛋白，独立于其与双氢睾酮的结合。靶向AR的药物会破坏依赖于双氢睾酮的AR信号。因此，这些药物可以抑制AR- FL蛋白的信号转导，但不能抑制AR- V7的信号转导。在CRPC患者中，多项临床前研究将疾病进展和死亡率与AR剪接变异的存在和丰度联系起来。在CRPC患者的循环肿瘤细胞(CTCs)中检测AR-V7的临床研究已经被4个独立的组证实与AR靶向药物的耐药性相关(见讨论部分)。然而，AR-V7的表达似乎不会对紫杉烷化疗反应产生不利影响。18e21 紫杉烷影响微管网络，导致AR的细胞质隔离，从而干扰AR的核信号。因此，如果有临床有效的检测方法，CRPC患者CTC中的AR-V7检测可以纳入治疗决策。尽管迄今为止有许多发表的研究支持AR-V7的临床意义，但该测试的分析性能尚未被报道。AR-V7测试现在有几个正在进行的临床试验：7个注册临床试验(1个III期试验，5个II期试验，和1个试点试验，https:// ClinicalTrials.gov，2016年1月3日)，使用术语“AR-V7”或“ARV7”(由莫恩和安托那拉基斯总结)。鉴于集合数据支持AR-V7作为一种诊断指标，以及需要通过临床试验进一步进行临床验证，AR-V7试验的分析验证至关重要。在本报告中，我们描述了首个实验室开发的AR-V7检测的分析验证和性能特征，该检测在CLIA认证的实验室(注册时间：2015年8月13日)进行。
方法

细胞系和标本
前列腺癌细胞系LNCaP和LNCaP95，由罗博士的实验室提供，按照说明进行培养。验证包括对LNCaP细胞的AR-FL转录本和LNCaP95细胞的AR-V7转录本进行dDNA微卫星指纹技术、RT-PCR和Sanger测序等技术的检测验证。确认LNCaP95表达AR-V7后，以其RNA作为阳性对照，和人脾mRNA(分类号:636525;Clontech, Mountain View, CA)作为阴性对照。作为前列腺癌细胞分离的阳性对照，对LNCaP95细胞进行扩增、传代、计数，并在液氮中一次性保存(10000个细胞)。根据经验，与实验中的分析物峰值相比，需要更大数量的细胞。将细胞稀释到5 mL RPMI培养基中，与全血标本平行处理。采用38例健康骨髓供者的废弃外周血标本鉴定AR和AR-V7的表达(14例男性，年龄20 ~ 40岁；24例女性，年龄20 - 69岁)。来自转移性CRPC男性的血液样本(最少10毫升)用两个或更多酸性柠檬酸葡萄糖(黄盖)vacutainer 真空采血管 (BD, Franklin Lakes, NJ)收集并送往临床实验室。1管用于实验，2管用于重复。在样本采集24小时内富集CTCs，收集RNA(一般在4小时内完成)。CTC富集使用AdnaTest前列腺癌选择试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)，按照生产商的protocol对CTC进行富集。简单地说，该方法使用免疫磁珠通过上皮细胞和肿瘤相关抗原富集肿瘤细胞。带有专有抗体的磁珠被用于与外周血中的肿瘤细胞结合，并使用磁铁捕获(LSKMAGS15;MilliPore, Darnsted, Germany)。使用含有oligo-(dT)的AdnaTest前列腺癌检测试剂盒(Qiagen)从细胞裂解液中分离出mRNA。所有分离出的mRNA经SensiScript RT kit(货号:205213;Qiagen)在20ml反应中使用以下温度循环设置:37℃ 60min，93℃ 5min，4℃保存。阴性和阳性对照cDNA在同批次产生，并在20℃下一次性保存。互补DNA作为模板在多重PCR反应使用HotStar TaqMaster Mix(Qiagen)和混合引物(试剂盒提供)扩增三个肿瘤相关抗原mRNA(表皮生长因子受体,前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)和一个对照mRNAβ-肌动蛋白(ACTB)。使用以下PCR条件:95℃为15min，94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，42个Cycle，72℃10min;4℃保存。扩增的PCR产物用Agilent TapeStation 2200 (Agilent, Santa Clara, CA)检测以确认cDNA合成。qpcrSanger测序
使用表1中的引物对PSMA、PSA、AR-FL和AR-V7的qPCR扩增产物进行测序。该文的研究路线图如下所示：图 雄激素受体剪接变异7 (AR-V7)测试流程至少取两管(最好是三管)黄盖的试管的患者血液样本。两管重复。试验如下：从血液样本中富集循环肿瘤细胞(CTCs)，并分离mRNA。绿线代表AR-FL，红线代表AR-V7 mRNA。RNA被反转录成cDNA。cDNA用于扩增反应，然后电泳检测CTCs的存在。cDNA还被用作实时定量PCR的模板，扩增6个靶区，以调查CTC和AR-V7的存在。所有扩增的前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、AR-FL或AR-V7产物均经Sanger测序确认。紫色横杆为1500-bp;绿色横杆，25bp。
结果与讨论

我们的结果是开发了一个试验来检测转移性CRPC患者的CTC中AR-V7 mRNA。简单地说,我们先分离CTC,它们的存在与否可利用cDNA在多重PCR 扩增的三个肿瘤相关抗原(EGFR、PSA和PSMA)，再使用安捷伦TapeStation 2200进行检测。利用Oligo-d(T)分离富集细胞的mRNA，并反转录成cDNA。分别对6个目标mRNA进行重复的qPCR反应，包括两个内参基因转录本(ACTB和GAPDH)、三个前列腺特异性基因转录本(PSMA、PSA和AR-FL)和AR-V7 mRNA。对每种分析物进行定性解释，并将检测结果报告如下:
i)未检测到mRNA:当所有RT-PCR反应均失败ii)未检测到CTC:内参基因阳性，前列腺特异性标志物阴性iii)检测到CTCs /未检测到AR-V7:内参和前列腺特异性标志物均阳性iv)检测到CTCs /检测到的AR-V7。前列腺特异性标志物和AR-V7反应均为阳性。(PSA或PSMA扩增是CTC检测的证据。阳性对照(LNCaP95 mRNA)、阴性对照(人脾mRNA)和无模板对照(water))富集结果情况：图:供体血液DNA的微卫星图谱。B: LNCaP95 DNA微卫星图谱。C:供者血液的微卫星图谱在富集后添加了10,000个LNCaP95细胞。D:供者血液的微卫星图谱中富集了50,000个LNCaP95细胞。CTC富集后，大部分DNA(90%)来自前列腺癌细胞，显示有效富集。
表 富集结果：大约1350倍和294倍的富集qPCR，CTC的检出极限值为5个细胞，分析精度，诊断特异性，准确性结果见文章头部。分析灵敏度：LNCaP95 RNA的约1 pg中便可以检测出所有分析物，PSA转录产物的检测限为输入RNA的10pg。其中，检出细胞数极限值结果分析如下：图 不同数量的LNCaP95细胞被插入到健康供者的血液样本中，并使用Adna前列腺癌检测试剂盒和我们的试验进行检测。前列腺癌检测试剂盒后的TapeStation图显示，在添加了>5个细胞的样本中，前列腺相关抗原[前列腺特异性抗原(PSA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，表皮生长因子受体(EGFR)， -肌动蛋白(ACTB)]均有检出。B:雄激素受体剪接变异7 (AR-V7)实时定量PCR扩增的Ct值与LNCaP95加标细胞的数量成反比。紫色横杆为1500-bp;绿色横杆25bp。在转移性CRPC患者中发现AR-V7对AR靶向药物缺乏反应已经在4个研究小组中证实。Antonarakis等人的第一份报告约翰霍普金斯大学报告了62例患者使用恩杂鲁胺或阿比特龙治疗。18例(29%)患者在基线时表达了AR-V7，显示了缺乏PSA反应，与缺乏AR-V7表达的患者相比，无进展和总生存率显著降低。第二项研究来自德克萨斯州休斯顿，随访了60例接受恩杂鲁胺治疗的骨转移性CRPC患者。26%的患者骨髓标本中存在AR-V7(免疫组织化学检测蛋白水平)与对恩杂鲁胺治疗的最初耐药性有关。第三项来自德国的研究观察了37例接受激素治疗(enzalutamide或阿比特龙)的患者的临床反应。15例AR-V7阳性患者中只有1例(7%)对治疗显示PSA反应。最近，Scher等人进行了第四项研究 纪念斯隆凯特琳癌症中心使用独立的方法证实AR-V7的表达预测了对AR靶向药物缺乏反应。尽管需要更多的证据，但是我们认为AR-V7测试在临床上得到了充分的验证。在本研究中，我们对第一个定性的AR-V7试验进行了分析验证，具有较高的分析灵敏度、精度、诊断特异性和准确性。临床检测方法类似于之前罗博士的实验室所描述的方法， 但有以下区别：我们使用了序列特异性探针，而不是插入染料(SYBR green)，我们使用Sanger测序对扩增产物进行了测序。在我们的试验中，检测患者血液中的前列腺相关抗原转录物(PSA或PSMA)被解释为检测到CTC。由于在3例健康对照患者的血液中检测到AR-FL转录体，我们不使用AR-FL本身作为CTC阳性的证据。当另一个转录本(PSA或PSMA)呈阳性时，AR-FL阳性被用作CTC存在的补充证据。此外，在没有PSA和PSMA的情况下，没有患者有可检测到的AR-FL转录。我们目前的化验是定性的。低水平的AR-V7表达被报道为AR-V7阳性。定量的AR-V7差异是否与治疗的不同反应相关还有待确定。理论上，我们的实验中低水平的AR-V7阳性可能反映捕获了少量均为AR-V7阳性的CTC，也可能反映捕获的一小部分表达AR-V7的CTC。CTCs中是否存在肿瘤异质性，是否代表原位肿瘤，以及如何影响治疗反应，目前尚不清楚。因为我们的实验室是第一个通过CLIA认证的进行AR-V7检测的实验室，目前还不可能有实验室间的验证。我们计划对保存的cDNA进行重复测试。目前剩余样品随后由罗博士的实验室检测并比较结果。AR-V7和其他转录本的检测可以适用于下一代测序技术。CRPC患者对新激素治疗有耐药性，常采用紫杉烷化疗。紫杉烷类破坏细胞内微管运输，从而通过将AR蛋白隔离在细胞质中破坏雄激素信号。因此，它们对AR-FL和AR-V7 CRPCs患者均有效。然而，体外和异种移植模型系统的数据表明，当紫杉醇(多西紫杉醇)处理AR-V7时，AR-V7可以以不依赖微管的机制运输到细胞核，表达AR-V7的细胞可以摆脱生长抑制。相比之下，临床数据表明，表达ar - v7的CRPC患者使用紫杉烷类药物治疗时，与新的激素治疗相比效果更好。另一个研究表明，CRPC患者对卡巴他赛的反应与患者的AR-V7状态无关。前瞻性临床试验(例如，NCT02379390, https:// clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02379390，2016年11月18日)正在进行中，以确认AR-V7表达患者对紫杉烷的临床反应。除了紫杉烷类，一些新的治疗药物在针对AR剪接变体的临床前研究中显示了非常有意义的结果。这包括galeterone (Tokai Pharmaceuticals, Boston, MA)，一种AR靶向剂，可能抑制AR-FLe和AR-V7介导的信号传导;艾萨制药公司(EPI, Vancouver, CA)靶向AR N端结构域的小分子家族(包括EPI-506);靶向与AR结合促进其转录激活的溴域外蛋白家族的药物;氯硝柳胺，可抑制AR-FLe和AR-V7介导的临床前模型的转录活性。除了AR剪接变异体，CRPC患者对雄激素剥夺疗法耐药的几个不太常见的可能机制已被记录在案。这包括AR基因扩增和过表达、弱雄激素转化为强雄激素、肿瘤内雄激素产生、AR N端结构域的体细胞点突变以及通过雄激素独立通路刺激AR。我们的试验并没有发现这些可能的替代机制对雄激素剥夺疗法的耐药性。AR-V7阳性的CRPCs对紫杉烷反应的数据可能允许AR-V7在这种情况下作为临床可操作的治疗选择生物标志物。综上所述，转移性CRPC患者的AR-V7检测可作为临床相关的生物标志物，指导预后和治疗决策。几项正在进行的临床试验可能会提供关于这一高危人群的最佳治疗方案的信息。本报告记录了一种在CLIA认证实验室进行的AR-V7检测的开发，这是其进一步临床验证的关键第一步。

点击下方图片进入OmicStudio资料汇总（整合了B站和公众号中的精品资源，及时更新，永久有效）

云平台网址：https://www.omicstudio.cn

云平台特点：

• 免费免费免费

• 所见即所得

• 生信人员直接开发

• 可下载PPT格式

• 绘图带数据处理功能 

• 分析参数多样（结合多年售后经验提供） 

• 一键分析 

联川生物云平台OmicStudio至今已帮助28000+科研伙伴处理各类组学数据，点击量累计超77000+。目前提供多种云工具、生信分析流程以及各种干货资料和用户文章，已被Theranostics，Bioresource Technology Reports等杂志的多篇文章引用。

相关阅读

循环肿瘤细胞CTC富集技术助力肿瘤耐药与转移机制研究-临床研究的高端利器 | CTC专题
5千字带你了解2021年联川全转录组生信内容大升级！
故事专栏：新冠疫情让RNA疫苗崭露头角，未来接种方式迎来大变革
你问我答：高通量测序相关问题微问答-20210118
OBS免费神器：支持断点传续，让你的数据交付方便又快捷